RealTime Polymerase Chain Reaction (RealTime PCR)

ในระบบของพันธุศาสตร์เทคโนโลยี วิธี RealTime polymerase chain reaction หรือที่เรียกว่า quantitative real time polymerase chain reaction (Q-PCR/qPCR/qrt-PCR) หรือ kinetic polymerase chain reaction (KPCR) นั้นเป็นวิธีที่มีพื้นฐานอยู่บนการทำ PCR ซึ่งเป็นการเพิ่มและหาปริมาณของสารพันธุกรรมเป้าหมาย รวมทั้งสำหรับตัวอย่างที่มี สารพันธุกรรมจำเพาะที่ต้องการตรวจหามากกว่า 1 ตำแหน่งก็สามารถตรวจหาได้ด้วยวิธีนี้ วิธี Real Time PCR นี้สามารถใช้ตรวจหาปริมาณสารพันธุกรรมได้โดยอาศัยตัวติดตาม หรือ Probe ที่ติดสารเรืองแสงเป็นตัววัดปริมาณสารพันธุกรรมที่ได้จากการทำปฏิกิริยา

รูปที่ 1. Performance characteristic of TaqMan probe
ในระบบของ Abbott RealTime System นั้นชนิดของ Probe แต่ละชนิดได้ถูกพัฒนาขึ้นมาเพื่อให้เหมาะสมกับไวรัสแต่ละตัว ซึ่งมี Probe 3 ชนิดที่มีการนำมาใช้ใน Abbbott RealTime System ได้แก่
  1. รูปที่ 1B การทำงานของ Taqman Probe
    Linear Probe หรือ TaqMan Probe โดยในสภาวะปกตินั้นสารเรืองแสง (fluorophore) จะถูกยับยั้งการเรืองแสงไว้ด้วยตัวยับยั้ง (quencher) ในขณะที่ probe ขดตัวอยู่ด้วยกัน ในระหว่างขั้นตอนการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม probe จะทำการจับกับ DNA เป้าหมายที่มีเบสคู่สมกันที่อุณหภูมิประมาณ 60 องศาเซลเซียส และที่ขั้นตอนนี้เอนไซม์ Taq Polymerase จะใช้ exonuclease activity ในการตัดแยกสารเรืองแสงออกจากตัวยับยั้ง อุณหภูมิที่ใช้ในการ hybridize นั้น ต้องสูงกว่าอุณหภูมิที่ใช้ในการต่อสายเพื่อเพิ่มความจำเพาะในปฏิกิริยา TaqMan probe นี้สามารถใช้เพื่อแยกความหลากหลายทางพันธุกรรมได้ด้วย อย่างไรก็ตาม probe ชนิดนี้จะมีความยืดหยุ่นของ probe ได้น้อย Probe ชนิดนี้ถูกนำมาใช้ใน Abbott HBV RealTime System.
  2. รูปที่ 1A การทำงานของ Partially double
    stranded probe
    Partially Double Stranded linear DNA Probe เป็น probe ที่จับกันเป็นเส้นคู่ โดยมีสายที่ติดสารเรืองที่ปลายด้านหนึ่ง (5' end) และมีสาย DNA สั้นที่เข้าคู่กันอยู่ ซึ่งติดฉลากด้วยตัวยับยั้ง (3' end) ในภาวะที่ไม่มี DNA เป้าหมาย probe ทั้งสองเส้นจะจับตัวอยู่ด้วยกันทำให้ทั้งสารเรืองแสงและตัวยับยั้งอยู่ใกล้กัน เมื่อมีการจับกันระหว่าง probe ที่ติดสารเรืองแสงและ DNA เป้าหมายจะทำให้ตัวยับยั้งหลุดออกไป ทำให้สารเรืองแสงสามารถส่งสัญญาณออกมาได้

    คุณสมบัติเฉพาะตัวของ probe ชนิดนี้คือ เป็น probe ที่มีความสามารถในการจับกับ Target ที่มีความจำเพาะกันต่ำหรือ Target ที่มีลำดับเบสที่ไม่เข้าคู่กันกับ probe ได้ดี ซึ่งเรียกคุณสมบัตินี้ว่า Mismatch Tolerance ดังนั้น เป็นที่ทราบกันดีกว่าเชื้อ HIV-1 เป็นไวรัสที่มีอัตราการกลายพันธุ์ที่สูงมาก Abbott HIV-1 RealTime System จึงได้พัฒนาและใช้ probe ชนิดนี้ในการหาปริมาณสารพันธุกรรมของไวรัส HIV-1 เพื่อให้สามารถตรวจจับปริมาณไวรัสได้อย่างถูกต้องมากที่สุดแม้ว่าจะมีไวรัสที่กลายพันธุ์ไปก็ตาม

  3. รูปที่ 1C การทำงานของ Single stranded
    linear probe
    Single Stranded Linear Probe เป็น Linear probe ชนิดหนึ่ง เมื่อไม่มี DNA เป้าหมายprobe จะขดตัวเข้าด้วยกันทำให้เกิดการเรืองแสง เมื่อมีการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม และ DNA เป้าหมายเกิดขึ้น probe จะไปจับกับ DNA เป้าหมายทำให้สารเรืองแสงส่งสัญญาณออกมาได้โดยไม่ต้องใช้ exonuclease activity ของ polymerase แต่อย่างใด Probe ชนิดนี้นำมาใช้ใน Abbott HCV RealTime System, Abbott RealTime CT/NG , Abbott RealTime High Risk HPV และ Abbott RealTime CMV Abbott HCV RealTime System, Abbott RealTime CT/NG, Abbott RealTime High Risk HPV และ Abbott RealTime CMV

References:

1. www.wikipedia.com
2. www.abbott.com
3. M. J. Espy, J. R. Uhl, L. M. Sloan, S. P. Buckwalter, M. F. Jones, E. A. Vetter,J. D. C. Yao, N. L. Wengenack, J. E. Rosenblatt,F. R. Cockerill III, and T. F. Smith. Real-Time PCR in Clinical Microbiology: Applications for Routine Laboratory Testing. Clin Microb Rev 2006; 19(1): 165-256.
4. Shihai Huang, John Salituro, Ning Tang, Ka-Cheung Luk John Hackett, Jr Priscilla Swanson, Gavin Cloherty, Wai-Bing Mak, John Robinson and Klara Abravaya. Thermodynamically modulated partially double-stranded linear DNA probe design for homogeneous real-time PCR. Nucleic Acids Res. 2007; 35(16): e101
5. Next-Generation Genome Sequencing: Towards Personalized Medicine. Edited by Michal Janitz Copyright _ 2008 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinhei ISBN: 978-3-527-32090-5